Izolace DNA

Izolace DNA je proces, při kterém zajistíme rozpad buněk ve vybraném vzorku, a tedy uvolnění DNA volně do roztoku. Následně jsme schopni tuto DNA oddělit od veškerých nečistot, a získat tak čistý DNA izolát, který pak zamrazíme a můžeme využít v budoucnu.

 

Jak funguje izolace DNA?

Izolace DNA je proces získání DNA z biologického materiálu pomocí kombinace fyzikálních a chemických metod. V současné době se jedná o rutinní techniku molekulární biologie. Jako první izolaci DNA uskutečnil Friedrich Miescher v roce 1869. V té době ale netušil, že právě v této molekule je uložená dědičná informace, která je pro organismy jedním ze stěžejních prvků.

Samotný izolační proces nukleových kyselin, tedy i DNA, můžeme rozdělit na dva základní kroky:

Lyze buněk

Při lyzi buněk dochází k rozbití jejich buněčných membrán, a tedy k uvolnění DNA ze samotných buněk ven. Uvolnění DNA může být zapříčiněné mechanickým rozrušením, např. pomocí mechanického rozbití tkání, homogenizací v homogenizátoru nebo rozrušením za pomoci enzymů (proteináza), které je detailněji popsáno níže. Případně se může jednat o kombinaci obou postupů. Při lyzi se uvolní z buněk celý jejich obsah, tudíž vznikne komplexní směs obsahující zbytky buněčných stěn a membrán, proteinů, nukleových kyselin (včetně DNA) nebo polysacharidů a dalších nízkomolekulových složek (Obr. 1).

 

Přečištění nukleových kyselin

Následně je potřeba DNA přečistit od detergentů, ostatních složek lyzačního roztoku a dále od proteinů, solí a jiných nečistot, které by mohly omezovat další molekulární postupy. Zbytkové proteiny (např. nukleázy) se navazují na DNA, můžou ji degradovat a znemožňují tak další kroky v molekulární laboratoři.

 

Obr. 1: Princip izolace DNA (orig. K. Eliášová). V první zkumavce (zleva) se nachází tkáň v roztoku proteinázy a lyzačního pufru.  Po inkubaci dojde k rozpuštění tkáně a k vyplavení DNA z buněk. Tekutý lyzát přepipetujeme do kolonky s filtrem a po centrifugaci se DNA naváže na filtr (tekutinu pod filtrem vylijeme). Následně DNA na filtru přečistíme a v posledním kroku díky promývání dojde k uvolnění čisté DNA a získáme DNA izolát na další molekulární analýzy.