Polymerázová řetězová reakce

Metoda polymerázové řetězové reakce (z anglického Polymerase Chain Reaction, tedy PCR) slouží k namnožení námi vybraného krátkého úseku z celkové a velmi dlouhé DNA, kterou jsme získali při její izolaci. Během PCR dochází k cyklickému množení zvoleného úseku do miliardových počtů kopií, což je důležité pro vlastní sekvenaci DNA.

Polymerázová řetězová reakce je jedna z nejpoužívanějších metod molekulární biologie, která umožňuje namnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA. Tuto metodu vyvinul Kary Mullis v roce 1983, který za tento objev získal Nobelovu cenu za chemii v roce 1993.

Zdroj: nobelprize.org

PCR je metoda rychlého a snadného namnožení úseku DNA založena na principu replikace nukleových kyselin. Organismy využívají pro replikaci DNA speciální bílkovinu (protein), kterou označujeme jako DNA polymerázu.

PCR je založena na ohřívání a ochlazování směsi DNA vzorku právě s DNA polymerázou a dále volnými nukleotidy (stavebními kameny DNA) a primery, což jsou „značky“ umožňující ohraničit konkrétní úsek DNA, který chceme namnožit (přesněji jde o krátké sekvence DNA, tzv. oligonukleotidy, které pasují na konce námi zvoleného úseku).

K syntéze nového vlákna DNA se používá nejčastěji termostabilní DNA polymeráza bakterie Thermus aquaticus, odtud označení Taq polymeráza. Polymeráza pak zkopíruje pouze úsek mezi značkami (primery), přičemž využije volné nukleotidy, které slouží k tvorbě nových vláken.

Cyklus reakce se opakuje až 40× a počet kopií námi zvoleného úseku DNA tedy exponenciálně roste (řádově do miliard), jelikož dochází i k množení nově vznikajících úseků z předchozích cyklů. PCR probíhá v zařízení zvaném termocykler.

Příprava na PCR; mikrozkumavky v chlazeném fialovém stojánku, PCR chemie v chlazeném šedém stojánku, nastavitelná pipeta, vzorky DNA v oranžovém stojánku.

 

Princip PCR reakce

PCR je složena z několika kroků, přičemž se některé z nich pravidelné opakují:

Při iniciační denaturaci DNA se po dobu několika minut zahřívá na teplotu 94–98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice.

Další tři kroky se opakují 30–40×.

Během denaturace se DNA po dobu 20–60 s zahřívá na teplotu 94–98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice. Vzniká tak jednovláknová DNA, na kterou mohou v dalším kroku nasednout primery. Primery nasedají i na nově vzniklé fragmenty v každém cyklu.

Nasednutí primerů (annealing) probíhá při teplotě 45–65 °C. Při této teplotě primery aktivně nasedají na specifická místa DNA. Tento krok probíhá 20–60 sekund.

Při syntéze DNA (elongace) dochází k samotné syntéze DNA. K primerům se připojuje DNA polymeráza a s pomocí volných nukleotidů se syntetizuje komplementární vlákno DNA. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity mezi 72–80 °C. Doba tohoto kroku je závislá na délce fragmentu, který chceme syntetizovat. Pro délku cca 1000 bází postačuje čas cca 1 minuta.

Po ukončení cyklících se kroků je vhodné ještě pokračovat 5–10 minut v závěrečné elongaci DNA, aby bylo jisté, že všechny kopie zvoleného úseku jsou dokončené. Následně je PCR zchlazená na 4 °C. Výsledné PCR produkty uchováváme krátkodobě v lednici a při dlouhodobém uskladnění v mrazáku při -20 °C.

Princip PCR reakce (orig. K. Eliášová). 1. krok; denaturace, jednotlivá vlákna DNA se oddělí při teplotě 94 °C. 2. krok; nasedání primerů (annealing) při teplotě 45-65 °C. 3. krok; prodlužování vláken DNA za pomoci Taq polymerázy a volných nukleotidů (elongace) při teplotě 72 °C.